8 بهترین شاخص کلسیم فلورسنت سبز

با وجود بسیاری از امکانات ، انتخاب شاخص کلسیم مناسب برای یک روش شار Ca 2+ می تواند دشوار و خسته کننده باشد. برای ساده تر کردن این روند ، در اینجا همان چیزی است که ما آن را به عنوان هشت شاخص بهترین طول موج ، فلورسنت Ca 2+ در دسترس می دانیم.

معرفی

کلسیم یک یون همه گیر است که در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی دخیل است. به عنوان مثال ، کلسیم می تواند به عنوان یک پیام رسان دوم در مسیرهای فیزیولوژیکی عمل کند که باعث آزاد شدن انتقال دهنده های عصبی از نورون ها می شود. این یک بخش جدایی ناپذیر به عنوان یک کوفاکتور آنزیمی که فعالیت آنزیمی را تنظیم می کند ، بازی می کند و برای انقباض تمام سلولهای عضلانی ضروری است. از آنجا که تنظیم فیزیولوژیکی غلظت Ca2 برای شروع و پایداری چنین فرآیندهای سلولی حیاتی ضروری است ، بسیاری از ابزارهای کیفی و کمی برای این منظور توسعه یافته اند.

یک مسیر سیگنالینگ رایج تنظیم غلظت سیتوپلاسمی Ca 2+ مسیر فسفولیپاز C است. این مسیر با فعال سازی اهداف گیرنده پروتئین همراه G (GPCR) آغاز می شود. برای نظارت بر فعالیت GPCR ، ما روشهای شارپ Ca 2+ را که از شاخص های بسیار حساس قادر به تشخیص سیگنال های Ca2 استفاده می کنند ، توصیه می کنیم. تشخیص Ca2 داخل سلولی به طور گسترده ای برای توصیف آگونیست های GPCR و آنتاگونیست ها در کشف مواد مخدر و همچنین در نظارت بر فعالیت های سیناپسی در تحقیقات علوم اعصاب استفاده می شود.

fluo-3

Fluo-3 یکی از متداول ترین شاخص های کلسیم سبز موجود است. این نخستین بار توسط Tsien و همکارانش در اواخر دهه 1980 ساخته شد (Grynkiewicz و همکاران 1985). از آن زمان ، Fluo-3 و آنالوگ های آن در بسیاری از برنامه های تصویربرداری Ca2 استفاده شده است. کمک های قابل توجهی در درک پویایی مکانی فرآیندهای مرتبط با مسیرهای سیگنالینگ Ca2.

Fluo-3 یک شاخص قابل تحریک و یکپارچه با طول موج Ca 2+ با ویژگی های طیفی شبیه به فلورسئین است. Fluo-3 از خط لیزر آرگون 488 نانومتر به خوبی هیجان زده است و با استفاده از مجموعه فیلتر انتشار FITC قابل تجسم است. حداکثر طول موج جذب و انتشار به ترتیب در 506 نانومتر و 526 نانومتر است. در مقایسه با سایر شاخص های Ca 2+ ، Fluo-3 نسبتاً کمتری برای Ca2 دارد. این یک ثابت تفکیک کلسیم را نشان می دهد (k_d) از~390 نانومتر که می تواند اشکالات مرتبط با بافر سیتوزولی را در استراحت سطح Ca2 کاهش دهد~100 نانومتردر فرم رایگان Ca2 ، Fluo-3 در اصل غیر فلورسانس است. پس از اتصال Ca2 ، شدت فلورسانس Fluo-3 افزایش می یابد~100 برابر و در سطح Ca 2+ اشباع عملکرد کوانتومی از~0. 14

در مطالعات مقایسه ای گذشته ، سلولهای پر شده با Fluo-3 دامنه پویا به طرز مطلوبی در تشخیص شار ابتدایی و جهانی Ca 2+ حساس نشان داده اند. با این حال ، Fluo-3 نیاز به جوجه کشی در دمای 37 درجه سانتیگراد دارد و در نتیجه با افزایش فعالیت حمل و نقل آنیون حساس به همان دما حساس می شود. برای بهبود احتباس سلولی ، Probenecid ، یک مهار کننده حمل و نقل آلی آنیون آلی در هنگام بارگذاری سلول استفاده می شود. متأسفانه ، Probenecid می تواند برای سلول ها سمی باشد و در حالی که مانع از حمل و نقل آنیون خاص می شود ، ممکن است دیگران را فعال کند. علاوه بر حساس بودن به تغییرات دما ، Fluo-3 نیز حساس به pH و حساس به اتصال پروتئین است.

fluo-4

Fluo-4 یک شاخص کلسیم قابل تحریک قابل مشاهده است که از سلف آن ، Fluo-3 حاصل می شود. مانند Fluo-3 ، Fluo-4 یک شاخص غیر فلورسنت است که شدت آن افزایش می یابد~100 برابر پس از اتصال Ca 2+. علاوه بر این ، Fluo-4 یک آنالوگ از Fluo-3 است که دارای تغییرات ساختاری جزئی است که به یک شاخص روشن تر و قابل استفاده تر نسبت می دهد. با جایگزینی دو جایگزین کلر با فلوئورین ، Fluo-4 به عنوان تغییر طول موج نمایش می دهد~12 نانومتر به سمت طیف آبی. این یک حداکثر طول موج جذب جدید در 494 نانومتر را ایجاد می کند و Fluo-4 را با استفاده از خط لیزر آرگون 488 نانومتر از نظر کارآمدتر تحریک می کند. این ویژگی به یک سیگنال فلورسانس روشن تر در غلظت های رنگ پایین تر باعث می شود Fluo-4 در مقایسه با Fluo-3 کمتر شود. Fluo-4 نسبت به Fluo-3 با یک K 2+ اتصال Ca2 کمی بالاتر دارد._dمقدار 345 نانومتر. به همین دلایل ، Fluo-4 جایگزین بهتری برای استفاده با میکروسکوپ کانفوکال نسبت به Fluo-3 است.

اگرچه Fluo-4 یک سیگنال روشن تر و نسبت سیگنال به عقب را در تجزیه و تحلیل شار Ca2 از سلولهای چسبنده نشان می دهد ، اما هنوز هم در نمونه های زنده فقط از نظر متوسط فلورسنت است. درست همانطور که پیشینیان خود Fluo-3 ، Fluo-4 از استفاده از Probenecid برای بهبود احتباس رنگ استفاده می کند ، که برای سلول ها سمی است.

fluo-8

Fluo-8 یک نشانگر کلسیم سبز جدید است که شامل همان هسته فلورسئین است که در Fluo-3 و Fluo-4 مورد استفاده قرار می گیرد ، برای نظارت بر غلظت Ca2+ و شار در سلول ها. این امر باعث می شود Fluo-8 بتواند در حالی که محدودیت هایی را که باعث ایجاد Fluo-3 و Fluo-4 می شوند ، از خواص طیفی یکسان با FLUO-4 حفظ کنند. اصلاحات ساختاری جزئی که مربوط به شروع Fluo-8 است ، منجر به پیشرفت های مختلف در ارتباط با اشتغال آن شده است که یکی از آنها شرایط بارگیری Fluo-8 است. در مقایسه با Fluo-3 و Fluo-4 ، که نیاز به بارگذاری شاخص در دمای 37 درجه سانتیگراد دارند ، Fluo-8 را می توان با موفقیت در دمای اتاق بارگیری کرد و زمان بارگذاری مورد نیاز را فقط 20 دقیقه کاهش داد.

مانند سایر رنگهای فلوو ، Fluo-8 به شکل رایگان Ca 2+ غیر فلورسنت است. پس از اتصال به Ca2 ، Fluo-8 افزایش شدت فلورسانس را نشان می دهد~200 برابراین به طور قابل توجهی دو برابر روشن تر از Fluo-4 و چهار برابر روشن تر از Fluo-3 است. Fluo-8 در مقایسه با سایر پروب ها وابسته به دمای کمتری است ، که امکان نتایج سازگار و قابل تکرار تر را در دمای اتاق یا 37 درجه سانتیگراد فراهم می کند. Fluo-8 و آنالوگ های آن به صورت چهار شکل مجزا در دسترس هستند که هر یک از آنها پیوسته های مختلف اتصال کلسیم را بیان می کنند. Fluo-8 دارای k است_dاز~389 نانومتر ، Fluo-8H دارای k است_dاز~232 نانومتر ، Fluo-8L دارای k است_dاز~1. 86 میکرومتر و Fluo-8ff دارای k است_dاز~10 میکرومترFluo-8L و Fluo-8FF به طور قابل توجهی نسبت به اتصال Ca2 به طور قابل توجهی پایین تر هستند و باعث می شوند آنها برای تشخیص سطح Ca 2+ داخل سلولی در محدوده میکرومولار مناسب تر باشند.

CAL-520

Cal-520 یک شاخص کلسیم فلوروژن جدید با چندین پیشرفت و مزایای قابل توجه در مقایسه با نسل های قدیمی شاخص های Ca2+ مانند Fluo-3 و Fluo-4 است. یک پیشرفت در CAL-520 تغییر در طول موج جذب و انتشار بهینه آن است~12 نانومتر کوتاهتر از Fluo-3 ، و در نتیجه حداکثر طول موج جذب 494 نانومتر است. این امر به طور قابل توجهی بازده تحریک Cal-520 را به 94 ٪ از اوج حداکثر خود افزایش می دهد که توسط خط لیزر آرگون 488 نانومتر که به طور قابل توجهی کارآمدتر از 40 ٪ Fluo-3 است ، هیجان زده می شود. Cal-520 با حداکثر انتشار در 514 نانومتر ، یک شاخص عالی برای برنامه های چند برابر با استفاده از یک نشانگر با فلورسانس قرمز است. علاوه بر این ، کارایی بهبودی CAL-520 باعث می شود تا استفاده از آن در غلظت های کمتری سمی یا کم رنگ باشد. این برای آزمایش هایی که برای بررسی اندازه گیری های داخل سلولی Ca2 از طریق میکروسکوپ کانفوکال با کاهش اثرات اشباع فلورسانس بر تصویربرداری ، سودمند است.

در مقایسه با Fluo-3 و Fluo-4 ، Cal-520 نسبت به Ca2 با k میل کمی بالاتر دارد_dمقدار 320 نانومتر. علاوه بر این ، CAL-520 در سیتوزول بهینه و بومی سازی می شود. این باعث می شود که نشانگر نشانگر در اندامک هایی مانند میتوکندری باشد و تضمین می کند که سیگنال تشخیص داده شده بازتاب دقیقی از تغییرات غلظت سیتوزولی Ca2+ است. Cal-520 یک کاوشگر قوی برای تشخیص سنجش مبتنی بر فلورسانس از بسیج کلسیم داخل سلولی است. برای ارزیابی اهداف GPCR و کانال کلسیم و همچنین برای غربالگری آگونیست و آنتاگونیست های آنها بسیار حساس است.

CAL-520 در فرم های Am Ester ، Salt ، Dextran و فرم های بیوکونژوژات در دسترس است تا هرگونه طراحی آزمایشی را در خود جای دهد. یک مزیت قابل توجه در استفاده از Cal-520 AM ، از بین بردن پروبنوسید است که می تواند برای سلولهای زنده سمی باشد. بیوکونژوگات CAL-520 ، مانند بیوسیتین Cal-520 و بیوتین ، می توانند بدون تغییر حساسیت آن در تشخیص پاسخ های Ca2 به Avidin و Streptavidin متصل شوند. ترکیبات Cal-520 Dextran می تواند از طریق اندوسیتوز توسط سلول ها میکروین شود یا توسط سلول ها گرفته شود. ترکیبات Cal-520 Dextran بسته به نوع بافت مورد بررسی ، به 3000 یا 10،000 مولکول Dextran با وزن مولکولی کونژوگه شده است.

CALBRYTE-520

Calbryte-520 یک نشانگر نسل بعدی Ca2 است که اخیراً به عنوان جایگزینی برتر برای شاخص های سنتی کلسیم سبز مانند Fluo-3 و Fluo-4 معرفی شده است. با تحریک فلورسانس و حداکثر انتشار 492 نانومتر و 514 نانومتر ، Calbryte-520 بهترین شاخص در این لیست است که برای تحریک کارآمد در خط لیزر آرگون 488 نانومتر مناسب است. خواص طیفی Calbryte-520 از نزدیک با Fluo-4 ، CalciM Green-1 و Oregon Green 488 Bapta-1 مطابقت دارد و امکان انتقال یکپارچه بین Calbryte 520 و هر یک از این سه شاخص را فراهم می آورد. Calbryte 520 به صورت استر یا به عنوان مشتق نمک پتاسیم در دسترس است. Calbryte 520 ، نفوذپذیری سلول AM آن را برای سنجش غلظت های Ca2 در سلولهای زنده مناسب می کند ، در حالی که ، Calbryte 520 ، قابلیت نفوذپذیری سلول نمک پتاسیم باعث می شود که برای کالیبراسیون شاخص های Ca 2+ مناسب باشد.

در طول توسعه Calbryte 520، بهبودها بر افزایش قابل توجه نسبت سیگنال به پس زمینه آن متمرکز بود. برای کاهش تداخل پس زمینه، Calbryte 520، AM غیرفعال و غیرفلورسنت باقی می ماند و کمترین پاسخ را به Ca2+ موجود در محلول خارج سلولی نشان می دهد. استرهای AM انتشار غیرفعال Calbryte 520 را در غشای سلولی تسهیل می کنند، جایی که استرازهای درون سلولی غیر اختصاصی گروه های عاملی استر AM را جدا می کنند و فلورسانس Calbryte-520 و پاسخ دهی به Ca2+ را فعال می کنند. مزیت قابل توجه استفاده Calbryte-520 حذف پروبنسید برای بهبود ماندگاری رنگ است (به غیر از Cal-520، همه شاخص های دیگر Ca 2+ ذکر شده در این لیست به پروبنسید نیاز دارند). Calbryte-520 فعال شده، حفظ سلولی و محلی سازی عالی در داخل سیتوزول را نشان می دهد. این تضمین می کند که سیگنال شناسایی شده ارزیابی دقیقی از سطوح Ca2+ داخل سلولی است.

مانند همه شاخص های کلسیم، Calbryte-520 در اثر کیلاسیون به Ca2+ آزاد، در شدت فلورسانس افزایش می یابد. را~افزایش 300 برابری در شدت فلورسانس نشان داده شده توسط Calbryte-520، بزرگترین افزایش پس از آن Fluo-8 است.~افزایش 200 برابری و سپس الف~افزایش 100 برابری توسط Fluo-3، Fluo-4، Cal-520 و Oregon Green 488 BAPTA-2 نشان داده شده است. بازده کوانتومی Calbryte-520 سه برابر بیشتر از Fluo-3 یا Fluo-4 است و K را نشان می دهد._dمقدار 1200 نانومترچنین ویژگی هایی Calbryte-520 را به یک شاخص بسیار حساس برای سنجش شار کلسیم و صفحه نمایش با توان بالای آگونیست ها و آنتاگونیست های GPCR تبدیل می کند. Calbryte-520 برای استفاده با میکروسکوپ لیزری کانفوکال، خوانندگان میکروپلیت فلورسانس و فلوسیتومتری بهینه شده است.

کلسیم سبز-1

Calcium Green-1 یک شاخص قابل مشاهده قابل تحریک نور است که از ترکیب فلورسنت فلورسین بدست می آید. کلسیم گرین-1 مانند پیشینیان فوق الذکر خود، Fluo-3 و Fluo-4، افزایش شدت انتشار فلورسانس خود را پس از اتصال به Ca2+ آزاد نشان می دهد. با حداکثر جذب و طول موج انتشار به ترتیب 506 نانومتر و 531 نانومتر، کلسیم سبز-1 برای تحریک توسط خط آرگون-لیزر مناسب است و با استفاده از مجموعه فیلتر انتشار FITC قابل مشاهده است.

در مقایسه با Fluo-3 و Fluo-4~100 برابر شدت افزایش می یابد، کلسیم سبز-1 به طور قابل توجهی کمتر است~14 برابر. با این حال، تمایل بیشتری به Ca 2+ دارد که K را نشان می دهد_dمقدار 190 نانومتر و عملکرد کوانتومی به طور قابل توجهی بیشتر از 0. 75 در غلظت های Ca2 اشباع. در غلظت های پایین تر Ca 2+ ، کلسیم سبز 1 از فلورسنت تر از Fluo-3 است که باعث بهبود دید سلول های استراحت می شود و باعث می شود سطح فلورسانس پایه و سطح Ca2 آسانتر شود. چنین خصوصیاتی همچنین اثرات فوتوتوکسیک کلسیم سبز 1 را کاهش می دهد. از آنجا که کلسیم سب ز-1 ذاتاً فلورسنت تر است ، به شدت روشنایی کمتری و غلظت رنگ کمتری نسبت به Fluo-3 نیاز دارد. متأسفانه ، مانند Fluo-3 و Fluo-4 ، کلسیم سب ز-1 برای بهبود احتباس سلولی که می تواند برای سلول ها سمی باشد ، به پروبنسید نیاز دارد.

کلسیم سب ز-1 به عنوان یک استر قابل نفوذ سلول در دسترس است ، یا به عنوان ترکیبات دکستران قابل نفوذ سلول و مشتقات نمکی مناسب برای تحقیقات مختلف سیگنالینگ کلسیم از جمله سنجش های شار Ca 2+ و تصویربرداری تحریک چند برابر از Ca2 در بافت های زنده. کلسیم سب ز-1 برای استفاده در سیستم عامل های مختلف فلورسانس مانند میکروسکوپ فلورسانس و فلوسیتومتری قابل تنظیم است.

کلسیم سب ز-5n

کلسیم سب ز-5N یک شاخص نسبتاً کم میل Ca2 با خصوصیات طیفی یکسان به عنوان کلسیم سب ز-1 است. از بین تمام شاخص های Ca 2+ که در این لیست ذکر شده است ، کلسیم سبز-5N دارای میل و ضعف قابل توجهی برای Ca2 با ثابت تفکیک بزرگتر در~14 میکرومتردر مقایسه با شاخص های K_dارزش های<1 μM, Calcium Green-5N’s larger K_dآن را برای ردیابی سینتیک دینامیک سریع کلسیم مناسب تر می کند. در مطالعات گذشته ، نشان داده شده است که کلسیم سبز 5N یک روش مناسب برای اندازه گیری غلظت های Ca2 تا حداقل 50 میکرومتر است. هنگامی که در رابطه با شاخص های Ca 2+ با میل بالا به کار می رود ، کلسیم سبز-5N می تواند نشانه ای از بزرگی مطلق سنبله های Ca2 در داخل سلول ها را فراهم کند.

پس از اتصال به Ca 2+ رایگان ، کلسیم سب ز-5N افزایش شدت فلورسانس را تقریباً تجربه می کند~38 برابر که دو برابر کلسیم سبز 1 است~افزایش 14 برابر. با این حال ، حتی با افزایش شدت انتشار بهتر ، کلسیم سبز-5N فلورسانس نسبتاً کمی به جز در سلولهایی که دارای یک شار Ca 2+ با دامنه بالا هستند ، نسبتاً کمی نشان می دهد. به دلیل چنین خصوصیاتی و کم بودن آن برای Ca2 ، کلسیم سب ز-5N ممکن است در تشخیص شار متوسط یا گذرا Ca2 بی حس شود.

Oregon Green 488 Bapta-1

Oregon Green 488 Bapta-1 (OG488 BAPTA-1) گروهی از شاخص های کلسیم فلوروژنیک روشن است که خصوصیات طیفی مشابه با کلسیم سب ز-1 را به اشتراک می گذارد. تفاوت عمده بین این دو تغییر OG488 Bapta-1 در جذب فلورسانس و حداکثر تحریک است~10 نانومتر کوتاهتر منجر به حداکثر طول موج جذب 494 نانومتر می شود. این به طور قابل توجهی بازده تحریک OG488 BAPTA-1 را در خط لیزر آرگون 488 نانومتر بهبود می بخشد. در راه حل های رایگان Ca2 ، OG488 BAPTA-1 نسبتاً فلورسنت است. پس از اتصال به Ca 2+ رایگان ، OG488 BAPTA-1 افزایش شدت انتشار فلورسانس را تجربه می کند~14 برابرمانند کلسیم سب ز-1 ، OG488 Bapta-1 دارای عملکرد کوانتومی تقریباً 0. 7 در حالی است که ثابت تفکیک کوچک را حفظ می کند~140 نانومترچنین خصوصیات طیفی OG488 BAPTA-1 استفاده از آن در غلظت های کم رنگ را فراهم می کند و آن را برای بررسی غلظت های داخل سلولی Ca2 با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزر کانفوکال مناسب می کند. علاوه بر این ، مطالعات برای اجرای یک سیستم شاخص کلسیم دوگانه با استفاده از OG488 BAPTA-1 شناخته شده است. به عنوان مثال ، از ترکیبی از OG488 BAPTA-1 و FLUO-4 برای بررسی پاسخ هایی که یک سطح سیگنال پایه محدود را با یک افزایش وابسته به محرک بزرگ ترکیب می کند ، استفاده شده است.